Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

ПЦР-диагностика: принцип работы и возможности

ПЦР-диагностика: принцип работы и возможности

Существующий чуть более 30 лет, метод диагностики инфекций с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) эволюционировал значительно и стал одним из наиболее точных и широко используемых способов выявления патогенных микроорганизмов.

Основой ПЦР является многократное увеличение концентрации фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. Этот процесс делает возможным копирование участка ДНК, который существует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

За несколько минут и несколько десятков циклов амплификации можно получить количество молекул, достаточное для дальнейшего анализа. Кроме того, с помощью ПЦР можно проводить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это делает ПЦР полезным не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Проведение ПЦР-диагностики требует специального оборудования и производится в специальных лабораториях. На сегодняшний день существует множество различных модификаций метода, включая технологии с использованием кислоты РНК. В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре и для их проведения не требуется специальное оборудование.

Популярным среди различных модификаций является "горячий старт ПЦР", который предварительно прогревает пробирки с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут для предотвращения клонирования неспецифических фрагментов ДНК.

Еще одной популярной модификацией является мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование нескольких фрагментов в одной пробирке. Это позволяет сократить время и затраты на проведение анализа и повысить точность исследования методом ПЦР.

ПЦР-диагностика - метод анализа, широко используемый в клинической медицине для выявления различных заболеваний. Данный метод имеет множество сфер применения, среди которых можно выделить следующие:

В урогинекологии

Метод помогает выявлять инфекционные заболевания, слабо проявляющие свои симптомы и имеющие хронический характер. ПЦР-диагностика позволяет определять наличие половых инфекций, таких как хламидиоз, микоплазма, уреаплазма, трихомониаз, гарднерелла, кандида, гонококк и трепонема. Кроме того, данный метод позволяет детектировать группу вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, включая вирус герпеса и вирус папилломы человека. Своевременное выявление и лечение данных инфекций способствует избежанию риска развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии

ПЦР-диагностика используется для выявления наличия неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. Данный метод является эффективным при выявлении опасных инфекций, таких как цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

В службе крови

Метод применяется для избежания риска переливания крови или плазмы, инфицированной опасными заболеваниями (ВИЧ, сифилис, гепатиты). ПЦР-диагностика значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку метод способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

В клинике инфекционных заболеваний

Метод помогает выявлять заболевания, такие как гепатит, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.

В фтизиатрии и пульмонологии

ПЦР-диагностика позволяет выявлять возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, данный метод позволяет не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, выявить конкретный штамм. Также метод ПЦР используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Другие сферы применения

Следует отметить, что ПЦР-диагностика имеет множество других сфер применения, таких как криминалистика, экспериментальная медицина, создание генетических паспортов, мониторинг состояния окружающей среды, анализ продуктов питания, фармакология и ветеринария.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що Полімеразна Ланцюгова Реакція (ПЦР) є відносно "молодим" методом, ключове місце в медичній практиці вона займає завдяки очевидним перевагам порівняно з іншими методами аналізу:

  • Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, і тому лише опосередковано вказують на присутність мікроорганізмів. Наявність специфічного участка в ДНК, виявленого за допомогою ПЦР, безпомилково або майже безпомилково вказує на присутність конкретної інфекції.
  • Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, який характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність виключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як в імунологічних методах досліджень помилки досить ймовірні через перехресну реакцію антигенів.
  • Висока чутливість. Завдяки ПЦР-діагностиці можна виявити присутність навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в організмі в тих випадках, коли звичайними методами це практично неможливо зробити. ПЦР визначає наявність всього 10-100 клітин у зразку, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна визначити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103-105.
  • Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість застосовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностуючи єдиновременно кілька збудників із одного біологічного зразка.
  • Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та виділення культури збудника, то і багато часу на це не потрібно. Весь цикл - від забору біоматеріалу до отримання результатів - займає 4-5 годин.
  • Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складні форми мікроорганізмів, які зустрічаються в тих випадках, коли захворювання перебігає у прихованій формі.

Методом ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але й у грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод диагностики инфекций с различным уровнем ценовой политики в разных клиниках. Стоимость ПЦР-анализа зависит от условий процедуры, включая целевые инфекции, виды анализируемого материала, а также методы тестирования – качественные или количественные. Обычно на определение одной инфекции расходуют от 200 до 800 рублей. Ключевым фактором является также оплата за сбор материала – до 400 рублей. В таблице 1 указана средняя стоимость ПЦР-диагностики различных видов.

Название анализа Цена, руб.
Определение ДНК хламидия 750
Определение ДНК микоплазмы хоминис 540
Определение микоплазмы гениталиум 350
Определение ДНК уреаплазмы 350
Гонококк, определение ДНК 350
Определение ДНК герпеса (разные типы) 350–600
Определение ДНК кандиды 570
Вирус краснухи, определение РНК 800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы) 350–1900

Многие медицинские центры предлагают комплексное проведение ПЦР-исследования, в рамках которого сразу происходит несколько анализов. Например, «ПЦР-8» (восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) – 1400 рублей или «ПЦР-12» (двенадцать половых инфекций) – 3500 рублей. Такая услуга существенно экономит деньги, поскольку отдельный ПЦР-анализ на каждую инфекцию обойдется гораздо дороже.

Фото: freepik.com

Комментарии (0)

Добавить комментарий

Ваш email не публикуется. Обязательные поля отмечены *